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小反芻獸疫病毒檢測試劑盒-PCR法

更新時間:2023-05-16      瀏覽次數(shù):902

【檢驗原理】

本試劑盒針對小反芻獸疫病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號

組成

25T/盒

50T/盒

1

PPRV  RT-PCR反應(yīng)液

437.5 μL×1管

875 μL×1管

2

PPRV 混合酶液

62.5 μL×1管

125 μL×1管

3

PPRV 陽性對照

40 μL×1管

 40 μL×1管

4

PPRV 陰性對照

40 μL×1管

 40 μL×1管

5

說明書

1份

1份

注:陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA,陽性對照為失去活性的小反芻獸疫病毒cDNA

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標本類型:發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標本采集,方法如下:

(1) 血清:用一次性注射器取靜脈血2-3ml,轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中,密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物:無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)5ml 離心管中,立即送檢。

(3) 組織臟器:取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,置一1.5ml的潔凈離心管中,密閉送檢。

3.應(yīng)避免標本間交叉污染。

4.標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應(yīng)凍存于-80以下,避免反復(fù)凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備(試劑準備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表

RT-PCR反應(yīng)液

17.5 μL

混合酶液

 2.5 μL

 

3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準備(樣本處理區(qū))

QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR(PCR擴增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。


反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集小反芻獸疫病毒熒光信號

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

    50℃:10分鐘(min)

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min)

1

PCR擴增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

 1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

 2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定:

1)陽性:標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

2)可疑:標本檢測結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

3)陰性:標本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標本檢測結(jié)果解釋

FAM

陽性(+)

標本中檢出小反芻獸疫病毒RNA

陰性(-)

標本中未檢出小反芻獸疫病毒RNA


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